Ученые из Медицинского колледжа Бэйлора (США) разработали новый метод полногеномной амплификации ДНК единичных клеток, благодаря которому можно выявлять спонтанные повреждения генома. Ониназвалиего LCS-WGA (linear copy and split-based whole-genome amplification method). Возникшие в результате повреждений de novo варианты авторы работы предложили обозначать как damSNV, а их совокупность в геноме — дамагеномом (damagenome).
Исследователи отмечают, что их метод позволяет выявлять только те повреждения ДНК, которые приводят к нуклеотидным заменам. LCS-WGA дает возможность обнаруживать повреждения, которые выявляют и массовые методы анализа ДНК, например, окисление гуанина до 8-оксогуанина.
Первая стадия LCS-WGA — это предамплификация, то есть получение линейных копий исходной геномной ДНК клетки с помощью ДНК-полимеразы, неспособной к самокоррекции (например, большого фрагмента полимеразы Bst), чтобы усилить сигнал от повреждений. Стадия предамплификации включает отжиг праймеров и их удлинение с образованием линейных полуампликонов, на основании которых затем синтезируются полные ампликоны. Поскольку полуампликоны синтезируются на матрице геномной ДНК независимо, то они несут различные ошибки амплификации. Ошибки амплификации в ампликонах, напротив, не являются независимыми, поскольку на основе одного полуампликона может быть синтезировано множество копий полного ампликона. Таким образом, разные полные ампликоны могут содержать одни и те же ошибки.
Далее в течение 30 циклов ПЦР без этапа плавления на матрице части одноцепочечных продуктов предамплификации синтезируется вторая цепь. В конце концов двуцепочечными становятся только полные ампликоны, а полуампликоны и геномная ДНК остаются одноцепочечными.
Следующим идет этап амплификации с множественным вытеснением (multiple displacement amplification, MDA). С помощью MDA увеличивается число копий только одноцепочечных продуктов, то есть геномной ДНК и полуампликонов. Так как ошибки амплификации в полуампликонах возникли независимо, есть возможность сравнить одни и те же участки ДНК в разных полуампликонах. Отмечая варианты, которые существуют в по крайней мере двух полуампликонах, можно отделить ошибки амплификации полуампликонов и выявить спонтанные мутации, произошедшие в геномной ДНК клетки.
По мнению авторов исследования, damSNV типа C➔T/G➔A связаны с окислением цитозина, A➔G/T➔C — с окислением аденина, а G➔T/C➔A — с появлением 8-оксогуанина.
Ученые опробовали новый метод, описав зависимость количества повреждений в ДНК единичных человеческих нейронов от возраста. Оказалось, что число damSNV в нейронах коры и гиппокампа у людей среднего возраста выше, чем у молодых или пожилых людей, но результат не был значимым.
Используя дамагеномные данные по человеческим нейронам, исследователи идентифицировали гены, в которых наиболее часто возникают повреждения. Они показали, что эти гены часто демонстрируют отличный от нормального уровень экспрессии при болезни Альцгеймера и расстройствах аутистического спектра. Таким образом, накопление повреждений в ДНК тесно связано с заболеваниями нервной системы.
https://pcr.news/novosti/razrabotan-metod-detektsii-spontannykh-povrezhdeniy-dnk-v-edinichnykh-kletkakh/